Importantes considerações na dosagem de citocinas no soro ou plasma.

Os níveis circulantes de citocinas e quimiocinas e outras proteínas são dosados a partir de plasma ou soro coletados de sangue periférico. É importante notar que os métodos de coleta e armazenamento de plasma ou soro são críticos para dosagens precisas.
A seguir estão algumas considerações importantes para dosagens dos níveis de citocinas e quimiocinas no soro ou plasma:

Existem vários tipos de tubos de coleta de sangue e devem ser selecionados com base na análise que está sendo feita, como diferentes anti-coagulantes  e produtos químicos diferentes. O plasma é obtido a partir de tubos de coleta contendo anticoagulantes, incluindo a heparina sódica ou lítio que agem inibindo a trombina da coagulação do sangue ou citrato de sódio ou EDTA que quelam íons de cálcio e previnem a coagulação. Os tubos de coleta de soro contêm ativadores de coágulos, contudo este método não permite a coleta de células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) no mesmo frasco, o que significa que, muitas vezes, o plasma será o produto de escolha para maximizar o valor do sangue extraído num número mínimo de tubos.​​


Serviço de dosagem Luminex - Multiplex: Após a coleta, o plasma ou o soro devem ser criopreservados a -80º C. Os níveis de citocinas e quimiocinas podem ser medidos por ensaio imunoenzimático (ELISA). No entanto, este método é demorado e permite a detecção de apenas um fator de cada vez. O Luminex, é um ensaio multiplex baseado em beads magnéticas e pode dosar até 100 citocinas, quimiocinas ou outras proteínas solúveis simultâneamente. Assim, para uma determinada coorte de doença, podem ser feitas múltiplas dosagens a partir de uma única amostra de soro ou plasma. Notavelmente, muitas citocinas e quimiocinas existem em níveis muito baixos no sangue periférico, assim, para cada citocina ou quimiocina a ser dosada é importante determinar se o range de detecção do ensaio utilizado é suficiente para os níveis circulantes dessa proteína. Além disso, os níveis destas proteínas podem variar dependendo se forem medidos em soro ou plasma coletados em vários anticoagulantes, sendo que as determinações devem ser feitas utilizando as metodologias mais semelhantes como comparações.

O trabalho metodológico de Jager et. Al, discute várias considerações importantes para analisar os níveis de citocinas a partir de soro ou plasma pela metodologia Luminex. Neste trabalho, devido a níveis incontestavelmente baixos de muitas citocinas,a fim de permitir determinações mais dinâmicas, ao sangue total foram acrescentadas citocinas recombinantes, ou tratados com LPS durante um período de tempo para aumentar a expressão das citocinas, antes da coleta do plasma, criopreservação e ensaios Luminex.

Umas das comparações feitas foi a diferença nos perfis de 15 citocinas no soro versus plasma dos mesmos doadores coletados em heparina de sódio, EDTA ou citrato. Em geral, os níveis de citocinas foram semelhantes, com algumas exceções, incluindo a IL-6 onde se observou valores mais baixos no soro em comparação com o plasma, enquanto que a CXCL8 foi significativamente mais elevada no soro. Os autores concluíram que o plasma coletado em heparina de sódio permitiu as melhores medidas globais para as citocinas avaliadas. O tempo gasto para processar e armazenar amostras após a coleta de sangue também pode influenciar os níveis de citocinas e deve ser feito da forma mais rápida possível para as comparações mais robustas.

Outro fator extremamente importante é o tempo de armazenamento da amostra. Assim como em todos os tipos de ensaios, a variação experimental deve ser minimizada, e por isso, é comum armazenar amostras de plasma ou soro até que a coorte inteira tenha sido coletada e depois analisar todas as amostras simultaneamente. Isto também entra em jogo quando as alterações nos perfis de citocinas ao longo do tempo devem ser dosadas a partir de amostras seriadas de um indivíduo. Os autores dosaram os níveis de citocinas no plasma coletado com heparina sódica armazenado a -80 º C por um período de até quatro anos. Várias citocinas incluindo IL-13, IL-15, IL-17 e CXCL8 começaram a degradar dentro de um ano de armazenamento, enquanto os níveis de IL-1α, IL-1β, IL-5, IL-6 e IL-10 foram degradando em mais de 50% em 2-3 anos. IL-2, IL-4, IL-12 e IL-18 foram muito mais estáveis, mantendo os seus níveis iniciais até 3 anos após o armazenamento inicial. Assim, dependendo das citocinas que estão sendo analisadas, é crítico manter essas questões em mente. Estes são os mesmos problemas enfrentados com o armazenamento de proteínas recombinantes que são usadas para gerar as curvas padrão de ELISA ou Luminex-Multiplex ou em outros ensaios de citocinas.

A estabilidade das citocinas após vários ciclos de degelo também foi avaliada. Quase todas as citocinas analisadas com a excepção de IL-6 e IL-10 foram afetadas pelos ciclos de degelo das amostras. Deste modo, quando se armazena amostras de plasma ou de soro, é importante congelar as amostras em alíquotas múltiplas de modo que possam ser realizados ensaios adicionais enquanto se evita este problema.

Em conclusão, o manuseio e armazenamento de amostras de soro e plasma bem como a escolha do soro versus plasma coletado em diferentes anticoagulantes são fatores importantes a serem considerados ao planejar estudos que incluirão a dosagem de citocinas circulantes e quimiocinas.

Leitura adicional:

Pré-requisitos para medições de citocinas em ensaios clínicos com imunoensaios multiplex. De Jager W, Bourcier K, Rijkers GT, Prakken BJ, Seyfert-Margolis V. BMC Immunol. 2009 28 de setembro; 10: 52. Doi: 10.1186 / 1471-2172-10-52.